A análise de amostras ou a identificação
de substâncias puras por ressonância magnética nuclear (RMN) é uma das
etapas em que se obtém mais informação sobre a natureza química de
compostos orgânicos, conhecidos ou não. Devido à versatilidade das
técnicas de RMN, bem como à quantidade de informações que se pode
extrair da análise de espectros de RMN, tais informações são
extremamente importantes. Para se obter análises de RMN de boa
qualidade, são necessários alguns cuidados fundamentais.
Em primeiro lugar, as amostras a serem
analisadas, sejam de frações complexas (misturas) ou de substâncias
puras, devem ser completamente solúveis nos solventes deuterados a serem
empregados. Caso este quesito não seja observado, a análise obtida
apresentará um espectro de baixa qualidade, muitas vezes com sinais
alargados, devido à presença de material insolúvel na amostra. Desta
forma, a seleção do solvente deuterado mais adequado é imprescindível,
não somente para se obter análises por RMN de boa qualidade, mas também
para se evitar manipulações excessivas com a mesma amostra. Logo, testar
a solubilidade da amostra em diferentes solventes não-deuterados antes
de se preparar a amostra no tubo de RMN é importante. Os solventes
deuterados mais utilizados são: CDCl3, DMSO-d6, MeOH-d4, MeCN-d3, acetona-d6, benzeno-d6, D2O.
No que se refere às particularidades de cada solvente, pode-se dizer que:
CDCl3 é o mais barato, sendo de fácil evaporação para recuperação da amostra. Todavia, a utilização de CDCl3
“100%” deuterado deve ser feita de maneira criteriosa, uma vez que tal
solvente contém quantidades traço de HCl. Por isso, caso seja necessário
utilizar tal solvente recomenda-se sua filtração através de uma pipeta
Pasteur contendo alumina (Al2O3) previamente lavada com CH2Cl2 de boa qualidade e seca em estufa.
DMSO-d6 é um
excelente solvente para se obter análises de RMN, principalmente porque
favorece muito a observação de sinais de hidrogênios “ativos” (sujeitos à
troca rápida), como os de grupos –OH, -NH, -NH2 e –SH, presentes em diversos grupos funcionais. A principal desvantagem em se utilizar DMSO-d6 é o seu alto ponto de ebulição (189º C), no caso em que se queira recuperar a amostra após a análise. Assim, o DMSO-d6 deve ser evaporado em sistemas de alto vácuo.
MeOH-d4 é um bom
solvente para se analisar amostras polares, mas apresenta várias
desvantagens, como seu alto custo, a dificuldade em se ajustar a
homogeneidade do campo no probe (“shimming”) para se realizar as
análises, ser muito higroscópico e, por apresentar um hidrogênio “ativo”
(OH), não permitir a visualização de hidrogênios desta natureza
eventualmente presentes na amostra. Por isso, a utilização de MeOH-d4
deve ser feita com muito critério, principalmente pelo seu preço.
Considera-se que praticamente todas as amostras solúveis em MeOH-d4 são também solúveis em DMSO-d6 ou em MeCN-d3,
mais baratos e que são mais adequados para se obter análises de forma
mais rápida, sem requerer tanto tempo de ajuste do “shimming”.
MeCN-d3 é um bom
solvente para análises de RMN, que dissolve substancias moderadamente
polares a polares e que não é tão caro (bem mais barato do que MeOH-d4).
Acetona-d6 costuma
ser utilizada para a análise de amostras moderadamente polares. Todavia,
sua principal desvantagem é sua volatilidade (evapora muito rápido,
mesmo no tubo de RMN fechado) e o fato de ser extremamente higroscópica
(acumular água do ambiente de maneira muito rápida).
Benzeno-d6 é
utilizado para a análise de amostras essencialmente apolares, e pode ser
muito útil. Isso porque alguns compostos apresentam muita sobreposição
de sinais de 1H quando seus espectros são obtidos em CDCl3. Tal sobreposição pode ser minimizada quando os espectros destas amostras são obtidas em benzeno-d6,
devido ao efeito de anisotropia magnética decorrente da deslocalização
dos elétrons no anel do benzeno. Tal fato foi observado principalmente
na análise de esteróis, esteroides e outros derivados terpênicos. Ou
seja, basta reobter espectros em benzeno-d6, ou ainda adicionar algumas gotas de solvente ao tubo contendo CDCl3 para se observar, às vezes, mudanças significativas nos deslocamentos químicos de sinais de 1H.
D2O (água deuterada) é
utilizada para a análise de compostos insolúveis em solventes orgânicos,
como sais ou compostos muito polares. Tal solvente também é utilizado
para se confirmar a presença de hidrogênios “ativos” em uma determinada
amostra. O espectro de RMN-1H desta deve ser primeiramente obtido em CDCl3. Subsequentemente, adiciona-se algumas gotas de D2O, agita-se o tubo de RMN e o espectro de RMN-1H é novamente obtido, quando se observa que os sinais dos hidrogênios “ativos” desaparecem.
Uma vez solubilizada a amostra em
solvente deuterado adequado (Entre 400 e 500 uL de solução de amostras em tubos de 5 mm), a solução da amostra a ser analisada deve
ser filtrada antes de ser transferida para o tubo de RMN. Isso pode ser
feito utilizando-se uma pipeta Pasteur com um pequeno chumaço de algodão
apertado, seja na ponta da pipeta (e succiona-se a solução de solvente
deuterado), ou através da pipeta. A filtração é necessária para se
eliminar eventuais partículas presentes na amostra, que podem
comprometer a qualidade das análises.
A utilização de tetrametilsilano (TMS)
como referência deve ser obrigatória, uma vez que a calibração da escala
de deslocamento químico do espectro de RMN (de 1H ou de 13C)
com o sinal do solvente residual não-deuterado pode ser influenciada
pela concentração da amostra e pela temperatura da análise. No caso da
utilização de TMS, apenas o vapor deste deve ser coletado com uma pipeta
Pasteur limpa, seca e com uma pêra que não tenha sido utilizada
recentemente na pipetagem de outra amostra, com um solvente qualquer. A
introdução da pipeta com vapor de TMS no tubo de RMN deve ser rápida,
pois o TMS é muito volátil.
Após a obtenção de todas as análises de
RMN que se deseja de uma determinada amostra, esta deve ser
imediatamente removida do tubo de RMN. Se isso não for feito, e a
amostra deixada dentro do tubo, ela poderá ficar parcialmente impregnada
em sua parede. Com o tempo, tal tubo de RMN se tornará inadequado para a
obtenção destas análises. Mesmo sendo ideal a remoção imediata das
amostras após a obtenção das análises de RMN, muitas vezes isso não é
possível. Sendo assim, tais tubos, se muito sujos após as amostras terem
sido removidas, podem ser limpos com solução de sulfonítrica (HNO3/H2SO4
1:1), e NUNCA com sulfocrômica [muito tóxica e deixa traços de Cr(III) e
Cr(IV), paramagnéticos]. O tubo com sulfonítrica deve deixado em um
béquer contendo água dentro de um banho de ultrassom durante cerca de 15
a 30 minutos. Após este período, deve-se remover a sulfonítrica com uma
pipeta Pasteur adequada, adicionar-se água de boa qualidade (de
preferência, MilliQ) várias vezes ao tubo (pelo menos 10 vezes), para em
seguida se enxaguar o tubo com MeOH ou EtOH de boa qualidade e por fim
com CH2Cl2. Os tubos devem ser guardados abertos,
ao abrigo de poeira, sujeira, umidade e outros possíveis contaminantes.
JAMAIS colocar tubos de RMN para secar em estufas aquecidas, pois estes
envergam-se e não mais se encaixam na sonda do aparelho; ou pior, uma
vez encaixados, podem não sair mais do aparelho.
Após a recuperação de amostras de RMN de dentro dos tubos, estes podem ser limpos com MeOH (ou EtOH) e depois CH2Cl2 (no caso de amostras polares) ou simplesmente com CH2Cl2 no caso de amostras apolares.
Tais cuidados na preparação de amostras
para obtenção de espectros de RMN evitam perda de tempo de manipulação e
de utilização do equipamento de RMN, desperdício de material e
possibilitam uma boa recuperação das amostras, além da manutenção
adequada dos tubos de RMN.
Bom dia! você poderia me falar um pouco sobre preparo de amostra em RMN 13C e se a análise é destrutiva?
ResponderExcluirDesde já, agradeço a atenção!