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segunda-feira, 9 de janeiro de 2012

Análises por RMN – alguns cuidados

Retirado do Blog parceiro Química de Produtos Naturais do professor Roberto G. S. Berlinck (IQSC-USP)

A análise de amostras ou a identificação de substâncias puras por ressonância magnética nuclear (RMN) é uma das etapas em que se obtém mais informação sobre a natureza química de compostos orgânicos, conhecidos ou não. Devido à versatilidade das técnicas de RMN, bem como à quantidade de informações que se pode extrair da análise de espectros de RMN, tais informações são extremamente importantes. Para se obter análises de RMN de boa qualidade, são necessários alguns cuidados fundamentais.
1H-NMR
Em primeiro lugar, as amostras a serem analisadas, sejam de frações complexas (misturas) ou de substâncias puras, devem ser completamente solúveis nos solventes deuterados a serem empregados. Caso este quesito não seja observado, a análise obtida apresentará um espectro de baixa qualidade, muitas vezes com sinais alargados, devido à presença de material insolúvel na amostra. Desta forma, a seleção do solvente deuterado mais adequado é imprescindível, não somente para se obter análises por RMN de boa qualidade, mas também para se evitar manipulações excessivas com a mesma amostra. Logo, testar a solubilidade da amostra em diferentes solventes não-deuterados antes de se preparar a amostra no tubo de RMN é importante. Os solventes deuterados mais utilizados são: CDCl3, DMSO-d6, MeOH-d4, MeCN-d3, acetona-d6, benzeno-d6, D2O.
No que se refere às particularidades de cada solvente, pode-se dizer que:
CDCl3 é o mais barato, sendo de fácil evaporação para recuperação da amostra. Todavia, a utilização de CDCl3 “100%” deuterado deve ser feita de maneira criteriosa, uma vez que tal solvente contém quantidades traço de HCl. Por isso, caso seja necessário utilizar tal solvente recomenda-se sua filtração através de uma pipeta Pasteur contendo alumina (Al2O3) previamente lavada com CH2Cl2 de boa qualidade e seca em estufa.
DMSO-d6 é um excelente solvente para se obter análises de RMN, principalmente porque favorece muito a observação de sinais de hidrogênios “ativos” (sujeitos à troca rápida), como os de grupos –OH, -NH, -NH2 e –SH, presentes em diversos grupos funcionais. A principal desvantagem em se utilizar DMSO-d6 é o seu alto ponto de ebulição (189º C), no caso em que se queira recuperar a amostra após a análise. Assim, o DMSO-d6 deve ser evaporado em sistemas de alto vácuo.
MeOH-d4 é um bom solvente para se analisar amostras polares, mas apresenta várias desvantagens, como seu alto custo, a dificuldade em se ajustar a homogeneidade do campo no probe (“shimming”) para se realizar as análises, ser muito higroscópico e, por apresentar um hidrogênio “ativo” (OH), não permitir a visualização de hidrogênios desta natureza eventualmente presentes na amostra. Por isso, a utilização de MeOH-d4 deve ser feita com muito critério, principalmente pelo seu preço. Considera-se que praticamente todas as amostras solúveis em MeOH-d4 são também solúveis em DMSO-d6 ou em MeCN-d3, mais baratos e que são mais adequados para se obter análises de forma mais rápida, sem requerer tanto tempo de ajuste do “shimming”.
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MeCN-d3 é um bom solvente para análises de RMN, que dissolve substancias moderadamente polares a polares e que não é tão caro (bem mais barato do que MeOH-d4).
Acetona-d6 costuma ser utilizada para a análise de amostras moderadamente polares. Todavia, sua principal desvantagem é sua volatilidade (evapora muito rápido, mesmo no tubo de RMN fechado) e o fato de ser extremamente higroscópica (acumular água do ambiente de maneira muito rápida).
Benzeno-d6 é utilizado para a análise de amostras essencialmente apolares, e pode ser muito útil. Isso porque alguns compostos apresentam muita sobreposição de sinais de 1H quando seus espectros são obtidos em CDCl3. Tal sobreposição pode ser minimizada quando os espectros destas amostras são obtidas em benzeno-d6, devido ao efeito de anisotropia magnética decorrente da deslocalização dos elétrons no anel do benzeno. Tal fato foi observado principalmente na análise de esteróis, esteroides e outros derivados terpênicos. Ou seja, basta reobter espectros em benzeno-d6, ou ainda adicionar algumas gotas de solvente ao tubo contendo CDCl3 para se observar, às vezes, mudanças significativas nos deslocamentos químicos de sinais de 1H.
D2O (água deuterada) é utilizada para a análise de compostos insolúveis em solventes orgânicos, como sais ou compostos muito polares. Tal solvente também é utilizado para se confirmar a presença de hidrogênios “ativos” em uma determinada amostra. O espectro de RMN-1H desta deve ser primeiramente obtido em CDCl3. Subsequentemente, adiciona-se algumas gotas de D2O, agita-se o tubo de RMN e o espectro de RMN-1H é novamente obtido, quando se observa que os sinais dos hidrogênios “ativos” desaparecem.
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Uma vez solubilizada a amostra em solvente deuterado adequado (Entre 400 e 500 uL de solução de amostras em tubos de 5 mm), a solução da amostra a ser analisada deve ser filtrada antes de ser transferida para o tubo de RMN. Isso pode ser feito utilizando-se uma pipeta Pasteur com um pequeno chumaço de algodão apertado, seja na ponta da pipeta (e succiona-se a solução de solvente deuterado), ou através da pipeta. A filtração é necessária para se eliminar eventuais partículas presentes na amostra, que podem comprometer a qualidade das análises.
A utilização de tetrametilsilano (TMS) como referência deve ser obrigatória, uma vez que a calibração da escala de deslocamento químico do espectro de RMN (de 1H ou de 13C) com o sinal do solvente residual não-deuterado pode ser influenciada pela concentração da amostra e pela temperatura da análise. No caso da utilização de TMS, apenas o vapor deste deve ser coletado com uma pipeta Pasteur limpa, seca e com uma pêra que não tenha sido utilizada recentemente na pipetagem de outra amostra, com um solvente qualquer. A introdução da pipeta com vapor de TMS no tubo de RMN deve ser rápida, pois o TMS é muito volátil.
Após a obtenção de todas as análises de RMN que se deseja de uma determinada amostra, esta deve ser imediatamente removida do tubo de RMN. Se isso não for feito, e a amostra deixada dentro do tubo, ela poderá ficar parcialmente impregnada em sua parede. Com o tempo, tal tubo de RMN se tornará inadequado para a obtenção destas análises. Mesmo sendo ideal a remoção imediata das amostras após a obtenção das análises de RMN, muitas vezes isso não é possível. Sendo assim, tais tubos, se muito sujos após as amostras terem sido removidas, podem ser limpos com solução de sulfonítrica (HNO3/H2SO4 1:1), e NUNCA com sulfocrômica [muito tóxica e deixa traços de Cr(III) e Cr(IV), paramagnéticos]. O tubo com sulfonítrica deve deixado em um béquer contendo água dentro de um banho de ultrassom durante cerca de 15 a 30 minutos. Após este período, deve-se remover a sulfonítrica com uma pipeta Pasteur adequada, adicionar-se água de boa qualidade (de preferência, MilliQ) várias vezes ao tubo (pelo menos 10 vezes), para em seguida se enxaguar o tubo com MeOH ou EtOH de boa qualidade e por fim com CH2Cl2. Os tubos devem ser guardados abertos, ao abrigo de poeira, sujeira, umidade e outros possíveis contaminantes. JAMAIS colocar tubos de RMN para secar em estufas aquecidas, pois estes envergam-se e não mais se encaixam na sonda do aparelho; ou pior, uma vez encaixados, podem não sair mais do aparelho.
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Após a recuperação de amostras de RMN de dentro dos tubos, estes podem ser limpos com MeOH (ou EtOH) e depois CH2Cl2 (no caso de amostras polares) ou simplesmente com CH2Cl2 no caso de amostras apolares.
Tais cuidados na preparação de amostras para obtenção de espectros de RMN evitam perda de tempo de manipulação e de utilização do equipamento de RMN, desperdício de material e possibilitam uma boa recuperação das amostras, além da manutenção adequada dos tubos de RMN.


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